НАУЧНЫЕ РАБОТЫ/

Анализ для определения вакцинного и вирулентного штаммов вируса КЧС методом рестрикции
КЧС - серотест

Разработка препаратов нового поколения для диагностики и профилактики классической чумы свиней.

Эпизоотии классической чумы свиней представляют серьезную экономическую проблему, т.к. сопровождаются гибелью большого числа животных. В связи с этим необходима быстрая и специфическая диагностика, а также надежная профилактика КЧС. Мы уделяем внимание изучению молекулярных характеристик имеющихся высокоэффективных препаратов и созданию новых диагностических тестов и вакцин для борьбы с КЧС.

Выявление ВКЧС при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР)

ПЦР - это ферментативная амплификация (умножение) специфического участка вирусной РНК с использованием специфических олигонуклеотидных ДНК-праймеров, термостабильного фермента и других компонентов. Реакция позволяет выявить вирусную РНК и тем самым подтвердить присутствие вируса в биологическом материале. Разработанная нами система определения РНК вируса КЧС на основе ПЦР является универсальной и позволяет дифференцировать РНК вируса КЧС от РНК других пестивирусов (вируса диареи крупного рогатого скота) и от других возбудителей как вирусной, так и бактериальной природы. Чувствительность тест-системы составляет 10-10² ИД₅₀. Система определения РНК вируса КЧС на основе ПЦР позволяет выявлять как вирулентные, так и вакцинные штаммы вируса КЧС. К настоящему времени мы проанализировали более 5000 образцов из 28 регионов России и 17 регионов Белоруссии. При помощи ПЦР было проведено исследование по изучению персистенции вакцинного штамма в крови 80-дневных поросят, которое показало, что вакцинный вирус устойчиво обнаруживается только в течение 14 дней после вакцинации. Поэтому тест-систему для определения РНК вируса КЧС рекомендовано применять спустя две недели после вакцинации.

Живая аттенуированная вакцина КС и разработка способа ее дифференциации от полевых изолятов методом ПЦР и рестриктазного анализа

Вакцина КС получена на основе вакцинного штамма ЛК ВНИИВВиМ, который применялся в СССР на протяжении более 30 лет. При разработке метода дифференциации геном вакцинного штамма КС был полностью секвенирован (код доступа в генбанке AF132116). Геном вакцинного штамма был сопоставлен с геномами следующих референтных штаммов: Alfort 187, Alfort Tubingen, Brescia, CAP, Glentorf, ALD, GPE-, Chinese, C-strain, Riems, P97. Геном вируса КС имеет уникальные рестриктазные характеристики в 18 позициях по сравнению с референтными (известными и описанными) генотипами ВКЧС. Из них всего 3 были использованы для проверки метода идентификации вакцинного штамма КС. Три отдельных ПЦР/рестриктазных теста (с маркерными сайтами PstI, KpnI и BglII) были проверены для 19 полевых изолятов и 4 референтных штаммов. Для этого были получены амплификационные фрагменты кДНК, содержащие данные сайты. Фрагменты кДНК были обработаны соответствующими рестриктазами и проанализированы методом гель-электрофореза. Все исследованные полевые изоляты дифференцируются от КС и ЛК штаммов при помощи данного теста. В случае, если вирулентный изолят показывает результат, сходный с вакцинным штаммом, следует предположить, что такой изолят произошел из вакцинного штамма. Для того, чтобы оценить возможность подобного события, мы предприняли попытку филогенетической характеристики вакцинного штамма КС и Российских полевых изолятов ВКЧС, а также проанализировали результаты филогенетического анализа ВКЧС российских и зарубежных авторов. Генетическое типирование штамма КС проводили на основе фрагмента размером 10697 нуклеотидов (87% генома) из кодирующей области генома штамма КС. Для сравнения использовали референтные штаммы ВКЧС. Положение вакцинного штамма КС на основании полученных данных следующее: по европейской классификации он относится к группе 1, подгруппе 1.2, в которой основным референтным штаммом служит штамм Brescia. Для генотипирования полевых изолятов ВКЧС фрагмент в 190 нуклеотидных пар, соответствующий вариабельному 5’-концевому участку гена Е2, был проанализирован у 15 полевых изолятов. Все они попадают в группу 1, подгруппу 1.1, представителем которой являются референтные штаммы Alfort 187, ALD, Glentorf. Несмотря на широкий географический разброс, эти изоляты демонстрируют тесное генетическое родство. Изоляты, использованые в настоящей работе, выделены примерно в 1995 г., когда в России отмечалось повышенное количество вспышек КЧС. Из филогенетической картины следует, что эти вспышки вызваны, хотя и близкими, но разными штаммами. Не было обнаружено изолятов, эволюционно близких к вакцинным штаммам КС и ЛК ВНИИВВиМ. Наши данные сходны с результатами, полученными во ВНИИЗЖ (С. Безбородова), где анализировали также ген Е2 из другой группы изолятов ВКЧС, полученных на территории России в 1994-1999 гг. Таким образом, не обнаружено признаков реверсии вакцинных штаммов к дикому типу. Из этого следуют два основных вывода: (1) Вакцины КС и ЛК еще раз доказали свою безопасность, (2) Метод по идентификации вакцинного штамма можно применять на территории России.

Разработка иммуноферментного анализа для определения антител к вирусу КЧС и субъединичное вакцинирование при помощи рекомбинантного белка Е2.

Для борьбы с классической чумой свиней (КЧС) одним из перспективных направлений является разработка субъединичных вакцин и серологических методов отличия вакцинированных и инфицированных животных. Главный поверхностный гликопротеин Е2 вируса КЧС способен вызывать образование вирус-нейтрализующих антител и во многом определяет их спектр. Рекомбинантный белок Е2 из вакцинного штамма КС, а также из вирулентного штамма Ши-Мынь, был синтезирован в культуре клеток SF-21 и High-Five, используя бакуловирус в качестве экспрессирующего вектора. С целью достижения секреции у рекомбинантных продуктов удален гидрофобный С-концевой трансмембранный домен и добавлен N-концевой сигнальный полипептид из 38 аминокислот. Максимальное накопление рекомбинантных продуктов в клетках SF-21 достигается через 48 ч, а в среде - через 96 ч после заражения рекомбинантным бакуловирусом. В культуре High-Five как в клетках так и в культуральной среде максимальное накопление Е2 достигается через 96 ч. Уровень экспрессии Е2 достигает 5-10 мкг на 10⁶ клеток. Продукты экспрессии были очищены методом металло-аффинной хроматографии и их специфичность подтверждена в иммунохимических реакциях с рядом референтных моноклональных антител (МАТ). Показана возможность использования данного продукта для определения антител к вирусу КЧС методом конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). Исследованы протективные свойства рекомбинантного белка Е2 из вирулентного штамма Ши-Мынь вируса классической чумы свиней (КЧС) при иммунизации животных. Показано, что рекомбинантный белок Е2 в дозе 200 мкг предохраняет животных от заболевания после экспериментального заражения вирулентным штаммом ВКЧС. Разработанный конкурентный метод иммуноферментного анализа антител к Е2 обладает высокой чувствительностью и специфичностью и может быть использован для определения уровня антител как к Е2, так и к нативному вирусу КЧС.