|
Определение полной первичной структуры геномов трех изолятов,
полученных на разных стадиях пассирования штамма NADC-8 вируса
репродуктивного и респираторного синдрома свиней
 Вирус репродуктивного
и респираторного синдрома свиней (РРСС) вызывает различные
нарушения функции воспроизводства у свиноматок и респираторные
нарушения в основном у поросят.
Вирус РРСС относится к роду Arterivirus, семейству Arterividae, отряду
Nidovirales. К этому роду также относятся вирус артерита лошадей (equine
arteritis virus), вирус повышения уровня лактатдегидрогеназы мышей
(lactate dehydrogenase-elevating virus of mice) и вирус геморрагической
лихорадки обезьян (simian hemorrhagic fever virus). Быстрому распространение
вируса способствует его длительная персистенция в зараженных животных,
присутствие в сперме, высокая контагиозность.
Геном вируса РРСС
представлен одноцепочечной молекулой РНК положительной полярности,
состоящей из 15,1 тыс. нуклеотидов. Он имеет 8 трансляционных рамок
(ORF). Из них ORF 1a и ORF 1b кодируют неструктурные белки, входящие
в полимеразный комплекс, ответственный за репликацию и транскрипцию
вирусного генома. Структурные белки кодированы рамками ORF2-ORF7.
В ходе транскрипции генов структурных белков образуются 6 перекрывающихся
молекул мРНК разной длины с общей 3’-концевой частью и с общей лидерной
последовательностью на 5’-конце. Вирулентный штамм NADC-8, ослабленный
вариант NADC-8 (251) и ревертировавший к дикому типу изолят NADC-8
(252p) были получены в Национальном центре болезней животных (NADC)
США в штате Айова, в лаборатории В. Менгелинга. Штамм NADC-8 (251)
был получен методом серийного пассирования штамма NADC-8 в перевиваемой
культуре клеток почек обезьяны 251 раз. Поскольку эффективность
роста вируса возрастала с количеством пассажей, то разведение при
пассировании менялось от 1:5 в ранних до 1:50000 в поздних пассажах.
Вирус из пассажа 251 был использован для заражения свиней и выделен
из одного животного через 4 недели (84 расчетных цикла репликации)
под именем NADC-8 (252p). В данной работе мы определили нуклеотидную
последовательность геномов у трёх описанных изолятов, всего более
45 тыс. нуклеотидов, с целью выявить изменения в первичной структуре,
потенциально связанные с наблюдаемыми фенотипическими изменениями
(степень вирулентности и адаптация к клеточной культуре). Для амплификации
и секвенирования геномных последовательностей было синтезировано
более 150 олигонуклеотидных праймеров. Геномы были амплифицированы
в виде перекрывающихся фрагментов, которые были очищены и напрямую
секвенированы с 2-6 кратным перекрыванием на 2 цепях. Концевые последовательности
геномов амплифицированы и клонированы в E.coli, после чего секвенированы
в 10-15 клонах каждый. Проводится анализ полученных результатов.
При сравнении изолятов NADC-8 и NADC-8 (251) обнаружен ряд аминокислотных
и нуклеотидных замен, накопленных за 251 пассаж. К настоящему времени
обнаружены две аминокислотные замены между изолятами NADC-8 (251)
и NADC-8 (252p). Обе найдены в структурных белках в областях ORF2
и ORF6 и представляют собой возврат к дикому типу, т.е. обе аминокислоты
совпадают у изолятов NADC-8 и NADC-8 (252p). Примечательно, что
среди структурных белков не найдено других аминокислотных замен,
несмотря на высокую генетическую изменчивость данного вируса. В
нашем распоряжении имеется еще набор из 3 изолятов штамма NADC-9
вируса РРСС, независимо полученных параллельно с тремя описанными
изолятами в том же режиме. Для них проведено частичное секвенирование
геномов в области ORF2-ORF7. Примечательно, что и там обнаружено
именно 2 замены с возвратом к дикому типу, в областях ORF2 и ORF6.
При этом точные координаты замененных аминокислот не совпадают.
В дальнейшей работе планируется экспериментально проверить закономерность
возникновения найденных (и других) мутаций в связи с изменениями
вирусного фенотипа.
|
|
