НАУЧНЫЕ РАБОТЫ/

Тест-система для определения вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) методом ПЦР

ОТЧЕТ

Загадочная болезнь свиней (mystery swine disease), болезнь синего уха - так в конце 80-х и начале 90-х называли репродуктивный и респираторный синдром свиней (РРСС), вызываемый вирусом PRRSV (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus). Заболевание впервые обнаружено в 1987 г. в Северной Каролине, США, после чего оно быстро распространилось по всей стране, в Канаде, Японии, Германии, в Нидерландах, Англии, Франции и Испании, Дании и в других регионах мира. При анализе сывороток свиней из коллекций прошлых лет в Онтарио (Канада) обнаружили антитела к вирусу в образцах 1979 г. в 2 хозяйствах и в 1980 г. в 8 хозяйствах, а в Айове (США) антитела обнаружили, начиная с 1985 г. Предполагается, что вирус распространился из Канады в США. Происхождение вируса неизвестно. Предполагают, что европейские и североамериканские типы вируса имеют различные эволюционные истории, т.к. их геномы сильно различаются.

Вирус РРСС относится к роду Arterivirus, семейству Arterividae, отряду Nidovirales (Cavanagh 1997). К этому роду также относятся вирус артерита лошадей (equine arteritis virus), вирус повышения уровня лактатдегидрогеназы мышей (lactate dehydrogenase-elevating virus of mice) и вирус геморрагической лихорадки обезъян (simian hemorrhagic fever virus).

Быстрому распространение вируса способствует его длительная персистенция в зараженных животных, его присутствие в сперме, высокая контагиозность.

Диагностика РРСС осуществляется при помощи пассирования инфекционного возбудителя в первичной культуре клеток альвеолярных макрофагов поросенка с последующим иммунохимическим окрашиванием пораженных клеток мечеными моноклональными антителами. Используется также полимеразная цепная реакция (ПЦР), этот метод безусловно хорош для выявления вирусов РРСС одного генетического типа (американского или европейского) и в особенности предпочтителен при анализе спермы. Существует и считается универсальным иммуноферментный метод определения антител к вирусу РРСС в сыворотке крови свиней, имеющий в качестве антигена зараженные вирусом клетки (и чистые клетки в качестве антигена сравнения)

Геном вируса РРСС представлен единой, линейной, одноцепочечной молекулой РНК положительной полярности, размером 15,1- 15,4 тыс. нукл. В геноме содержится 7 открытых трансляционных рамок (ORF1-ORF7). Большую часть генома (около 12 тыс. нукл.) занимают ORF1а-ORF1b, кодирующие неструктурные белки.

Задачей данного исследования было: создание тест-системы на основе ПЦР для определения РНК вируса РРСС в культурах клеток, крови, органах, сперме животных.

В качестве преимущества ПЦР как метода детекции вируса КЧС можно назвать его быстроту (анализ занимает 1- 2 дня, в зависимости от количества образцов), а также возможность проведения анализа в сперме животных.

ПЦР - это ферментативная амплификация (умножение) специфического участка вирусной РНК: в результате использования специфических олигонуклеотидных ДНК-праймеров, термостабильного фермента и субстратов реакции для термостабильного фермента (четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов) из нескольких копий вируса амплифицируются миллионы копий специфического участка вирусного генома. При этом, для РНК-содержащих вирусов первым этапом является получение из РНК копии ДНК (т. н. кДНК). Вторым этапом является проведение полимеразной цепной реакции. Полимеразная реакция - это серия повторяющихся циклов, состоящих из следующих стадий:

• денатурации (94-95^oС)
• отжига (гибридизации) праймеров ( 50-60^oС)
• полимеризации или элонгации (удлиннения) цепи ДНК (72^oС) с помощью термостабильного фермента ДНК-полимеразы

Серия повторяющихся циклов позволяет получить множественное (в идеальном случае 2ⁿ) увеличение матрицы.

Для разработки системы детекции РНК вируса PPCC неоходимо было решить следующие задачи:

1. Оптимизировать условий для выделение РНК вируса РРСС.
   
2. Подобрать специфические универсальные праймеры для детекции РНК вируса РРСС двух типов и оптимизировать условия для проведения ПЦР.
   
3. Проверить специфичность системы детекции РНК вируса РРСС методом ПЦР.
   
4. Исследовать возможность детекции РНК вируса РРСС методом ПЦР в сперме животных.
   

1. Выделение РНК из культур и патологического материала можно проводить несколькими способами. Классический метод выделения РНК – это метод выделения с использованием органических растворителей ( фенол, хлороформ и т. д.). Однако, данный метод трудоемок и требует навыков от оператора. Кроме того, работа с такими агрессивными веществами как фенол часто неудобна при скрининге большого количества проб и небезопасна для опереатора. Мы оптимизировали условия выделения РНК вируса РРСС и проводили выделение быстрым методом без использования фенола и других органических растворителей. При этом, суспензию культур (200-300 мкл) или кусочек ткани (10-20 мг, без предварительной гомогенизации) обрабатывали лизирующим раствором, а затем инкубировали с неорганическим “сорбентом”. Элюцию ДНК проводили в 30 мкл деионизованной воды. Объем проб физиологического раствора, крови и суспензии культур был идентичным. Достоинство данного метода выделения является его быстрота, безопасность для оператора и возможность стандартизации метода для детекции вируса РРСС.

2. Были подобраны специфические универсальные праймеры на участки ORF1a и ORF1b. Данные праймеры были исследованы с использованием референтных штаммов РРСС ( как американских, так и европейских). В результате исследований были выбраны праймеры на участок ORF1b . Была использована т. н. “гнездовая ПЦР” с использованием двух пар праймеров. Чувствительность ПЦР с использованием выбранных нами праймеров была 10 ИД50.

3. Специфичность проверяли с использованием панели контрольных образцов, представленных в таблице.

Таблица
Панель контрольных образцов

Таким образом, разработанная нами система детекции РНК вируса РРСС на основе ПЦР является универсальной и позволяет дифференцировать РНК вируса РРСС от других вирусов (вируса диареи крупного рогатого скота, вируса классической чумы свиней, вируса чумы плотоядных) и от других патогенов бактериальной природы.

4. Исследование полевых образцов. Преимуществом метода ПЦР для детекции РНК вируса РРСС является возможность проведения анализов в сперме животных. Были исследованы 96 образцов спермы жвотных , полученных из различных хозяйств России и Белоруссии. Чувствительность и специфичность разработанной тест-системы позволила определят РНК вируса РРСС в сперме животных. Были исследованы образцы крови и органов животных из 19 областей России и 14 областей Белоруссии. Результаты , полученные в каждом хозяйстве с использованием тест-системы ПЦР были дополнены данными, полученными с помощью фирменного иммунологического набора фирмы IDEX.

В результате оптимизации условий проведения РТ/ПЦР для определения РНК вируса РРСС, была создана чувствительная и специфичная тест-система для детекции РНК вируса РРСС методом полимеразной цепной реакции в культурах и образцах, полученных от животных. Были проведены государственные испытания тест-системы.